Получение, оценка специфической активности и подлинности рекомбинантной вакцины, предназначенной для профилактики синегнойной инфекции
Аннотация
Целью исследования явилось получение и характеристика рекомбинантной вакцины, предназначенной для иммунопрофилактики инфекций, вызываемых Pseudomonas aeruginosa. При создании вакцины использован комплекс двух высокоиммуногенных рекомбинантных белков P. aeruginosa. Первый компонент вакцины представлял собой рекомбинантную форму белка F наружной мембраны (OprF), а второй – рекомбинантную атоксическую форму (анатоксин) экзотоксина А. Эти антигены позволили разработать вакцину способную стимулировать иммунные реакции против поверхностных структур бактерии и способствовать синтезу нейтрализующих антител против экзотоксина А, одного из наиболее опасных факторов патогенности P. aeruginosa. Рекомбинантные белки синтезировали в клетках Escherichia coli и выделяли в результате двухэтапной очистки. В случае рекомбинантного белка OprF на первом этапе получали осадок, содержащий гидрофобную фракцию белков продуцента, а в случае рекомбинантного анатоксина – тельца-включения. На втором этапе проводили аффинную хроматографию в колонках с никель-сефарозой. Очищенные рекомбинантные белки диализовали против буферного раствора, содержащего 50 mМ Tris-HCl (pH 9,0) и 0,01 % Tween 20, а затем стерилизовали фильтрацией. Для исследования были получены три серии рекомбинантной вакцины синегнойной (РВС), в которой рекомбинантные антигены находились в сорбированном с гидроокисью алюминия состоянии. В этой вакцине рекомбинантный белок OprF использовали в дозе 25 мкг, а рекомбинантный анатоксин – в дозе 50 мкг. Определение полноты сорбции рекомбинантных антигенов в составе вакцины оценивали методом электрофореза в полиакриламидном геле, используя для нанесения препараты РВС, сконцентрированные ультрафильтрацией в спин колонках. С целью оценки подлинности рекомбинантной вакцины разработали оригинальный метод. Для этого проводили десорбцию антигенов с последующей концентрацией препарата с помощью спин колонок. Полученные сконцентрированные десорбированные вакцинные препараты анализировали методом электрофореза в полиакриламидном геле и иммуноблоттингом. В результате чего, подтверждено наличие специфических рекомбинантных антигенов в составе вакцины. Экспериментальные серии РВС проявляли специфическую активность (защитные свойства) в эксперименте на животных (мышах). При этом использована схема двукратного, с двухнедельным интервалом внутрибрюшинной иммунизации, а затем через две недели мышей заражали токсигенной культурой P. aeruginosa штамма PA-103. Индексы эффективности защитных свойств (ИЭ) экспериментальных серий вакцины составляли не менее трех (ИЭ: 3,0 – 3,3), что превышало в полтора раза эффективность использования компонентов вакцины по отдельности (ИЭ: 2,0 – 2,3). Таким образом, подтвержден аддитивный эффект использования комплексного препарата для защиты от инфицирования токигенными штаммами синегнойной палочки.
Об авторах
А. А. Калошин
Федеральное Государственное Бюджетное Научное Учреждение «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» (ФГБНУ НИИВС им. Мечникова)
Россия
ведущий научный сотрудник лаборатории протективных антигенов, SPIN-код 3938-6140
Россия
ведущий научный сотрудник лаборатории протективных антигенов, SPIN-код 3938-6140
Е. М. Зимина
Бюджетное Научное Учреждение «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» (ФГБНУ НИИВС им. Мечникова)
Россия
младший научный сотрудник лаборатории протективных антигенов, SPIN-код 5332-1049
Россия
младший научный сотрудник лаборатории протективных антигенов, SPIN-код 5332-1049
Е. О. Калиниченко
Бюджетное Научное Учреждение «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» (ФГБНУ НИИВС им. Мечникова)
Россия
аспирант, младший научный сотрудниклаборатории механизмов регуляции иммунитета, SPIN-код 9835-5120
Россия
аспирант, младший научный сотрудниклаборатории механизмов регуляции иммунитета, SPIN-код 9835-5120
Н. А. Михайлова
Бюджетное Научное Учреждение «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» (ФГБНУ НИИВС им. Мечникова)
Россия
заведующий лабораторией протективных антигенов, SPIN-код 7717-5231
Россия
заведующий лабораторией протективных антигенов, SPIN-код 7717-5231
Список литературы
1. Благовидов Д. А., Костинов М.П., Симонова О.И., Шмитько А.Д., Буркина Н.И., Шахназарян М.К. Переносимость вакцины против P. aeruginosa у детей с муковисцидозом и врожденными пороками развития легких // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2016. Т. 15, №2 (87), С. 55-66. [Blagovidov D.A., Kostinov M.P., Simonova O.I., Shmit'ko A.D., Burkina N.I., Shahnazaryan M.K. The Tolerability of the Vaccine against P. aeruginosa in Children with Cystic Fibrosis and Congenital Lung Development. Epidemiology and Vaccinal Prevention, 2016, vol. 15, no. 2, pp. 55-66. https://doi.org/10.31631/2073-3046-2016-15-2-55-66 (In Russ.)]
2. Калошин А.А., Леонова Е.И., Солдатенкова А.В., Михайлова Н.А. Исследование протективных свойств комплекса рекомбинантного белка F наружной мембраны и рекомбинантного анатоксина Pseudomonas aeruginosa // Вестник Российской Академии Медицинских Наук. 2016. Т. 71, № 1 С. 17-22. [Leonova E.I., Soldatenkova A.V., Mihailova N.A. Assessment Protective Properties of the Recombinant Complex of the Outer Membrane Protein F and the Toxoid of Pseudomonas aeruginosa. Vestnik Rossiiskoi akademii meditsinskikh nauk, 2016; vol. 71, no. 1, pp. 117-22. doi: 10.15690/vramn584 (In Russ.)]
3. Лазарева А.В., Чеботарь И.В., Крыжановская О.А., Чеботарь В.И., Маянский Н.А. и др. Pseudomonas aeruginosa: патогенность, патогенез и патология // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2015. Т. 17, № 3, С. 170–186. [Lazareva A.V., Tchebotar I.V., Kryzhanovskaya O.A., Tchebotar V.I., Mayanskiy N.A. Pseudomonas aeruginosa: Pathogenicity, Pathogenesis and Diseases. Klinicheskaya mikrobiologiya i antimikrobnaya khimioterapiya, 2015, vol. 17, no. 3, pp. 170-186. (In Russ.)]
4. Макаренко Т.А., Станиславский Е.С. Иммунологическое изучение белков клеточной стенки Pseudomonas aeruginosa // Журнал микробиологии, эпидемиологии м иммунобиологии. 1996. № 2, C. 7-9. [Makarenko T.A., Stanislavskiĭ E.S. An immunological study of the cell wall proteins of Pseudomonas aeruginosa. Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol, 1996, no. 2, pp. 7-9. (In Russ.)]
5. Михайлова Н.А., Шаймухаметов Ф.А., Кузнецова Т.Н., Мороз А.Ф. Патент RU1481962C. Способ обезвреживания очищенного экзотоксина А синегнойной палочки. Заявлено 15.07.87; Опубликовано 09.06.95. [Mikhajlova N.A., Shajmukhametov F.A., Kuznetsova T.N., Moroz A.F. Method for rendering harmless exonoxin A of Pseudomonas aeruginosa. Patent RU1481962C, Claimed 15.07.87; Published 09.06.95. (In Russ.)]
6. Подгорная Л.Г., Дзюбан Н.Ф. Антигенные свойства анатоксина синегнойной палочки и протективное действие антитоксической противосинегнойной сыворотки // Журнал микробиологии, эпидемиологии м иммунобиологии. 1986. № 6, С. 67-69. [Podgornaia L.G., Dziuban N.F. Antigenic properties of Pseudomonas aeruginosa anatoxin and the protective action of antitoxic anti-Pseudomonas aeruginosa serum. Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol, 1986, no. 6, pp. 67-69. (In Russ.)]
7. Станиславский Е.С., Йоо И., Северцева М.К., Машилова Г.М., Болтуцкий Л.Г. Иммунологическая эффективность и безвредность в эксперименте пиоиммуногена-вакцины против инфекции Pseudomonas aeruginosa // Журнал микробиологии, эпидемиологии м иммунобиологии. 1982. № 5, С. 70-75. [Stanislavskiĭ E.S., Joó I., Severtsova MK, Mashilova GM, Boltutsiĭ LG. Experimental immunological effectiveness and safety of pyoimmunogen vaccine against Pseudomonas aeruginosa infection. Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol, 1982, no. 5, pp. 70-75. (In Russ.)]
8. Титова Т.И., Сидорова Т.Н., Радкевич С.А., Анциферова Н.Г., Мороз А.Ф. Получение и изучение свойств поливалентной корпускулярной синегнойной вакцины // Журнал микробиологии, эпидемиологии м иммунобиологии. 1985. № 8, С. 80-88. [Titova T.I., Sidorova T.N., Radkevich S.A., Antsiferova N.G., Moroz A.F. Production and study of the properties of a polyvalent corpuscular Pseudomonas aeruginosa vaccine. Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol, 1985, no. 8, pp. 80-88. (In Russ.)]
9. Chatterjee M., Anju C.P., Biswas L. et al. Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa and alternative therapeutic options. International Journal of Medical Microbiology, 2016, vol. no. 1, pp. 48-58. doi: 10.1016/j.ijmm.2015.11.004
10. Doring G. and Pier G.B. Vaccines and immunotherapy against Pseudomonas aeruginosa. Vaccine, 2008, vol. 26, no. 8, pp. 1011-1024. doi: 10.1016/j.vaccine.2007.12.007
11. Kaloshin A.A., Gatypova E.V., Mihailova N.A. Obtaining recombinant forms of the outer membrane protein F of Pseudomonas aeruginosa and assessment of their immunogenic properties. Applied Biochemistry and Microbiology, 2011, vol. 47, no. 8, pp. 780–788. doi: 10.1134/S0003683811080060
12. Kaloshin A.A., Isakov M.A., Mihailova N.A., Vertiev Ju. V. Preparation of Recombinant Atoxic Form of Exotoxin A from Pseudomonas aeruginosa. Bulletin of Experimental Biology and Medicine, vol. 154, no. 3, pp. 346-350. doi: 10.1007/s10517-013-1947-1
13. Lee N.G., Jung S.B., Ahn B.Y., Kim Y.H., Kim J.J., Kim D.K., Kim I.S., Yoon S.M., Nam S.W., Kim H.S., Park W.J. Immunization of burn-patients with a Pseudomonas aeruginosa outer membrane protein vaccine elicits antibodies with protective efficacy. Vaccine, 2000, vol. 18, no 18, pp. 1952-1961. doi.org/10.1016/S0264-410X(99)00479-X
14. Pharmacopoeia.ru – сайт о регистрации лекарственных средств в России, ОФС.1.2.4.0003.15 Стерильность. [Site about registration of Drugs in Russia and EAEU (CIS), ОФС.1.2.4.0003.15 Sterility.]
15. Sambrook J.F. and Russell D.W. Molecular cloning: a laboratory manual. 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
16. Shanmugham R., Thirumeni N., Rao V.S., Pitta V., Kasthuri S., Singanallur N.B., Lingala R., Mangamoori L.N., Villuppanoor S.A. Immunocapture enzyme-linked immunosorbent assay for assessment of in vitro potency of recombinant hepatitis B Vaccines. Clinical and vaccine immunology, 2010, vol. 17, no. 8, pp. 1252-60. doi: 10.1128/CVI.00192-10
Дополнительные файлы
При поддержке: Министерство науки и высшего образования РФ
Для цитирования:
Калошин А.А., Зимина Е.М., Калиниченко Е.О., Михайлова Н.А. Получение, оценка специфической активности и подлинности рекомбинантной вакцины, предназначенной для профилактики синегнойной инфекции. Инфекция и иммунитет. 2020;. https://doi.org/10.15789/2220-7619-OES-1369
For citation:
Kaloshin A., Zimina E., Kalinichenko E., Mihailova N. GENERATION AND EVALUATION OF SPECIFIC ACTIVITY AND AUTHENTICITY OF RECOMBINANT VACCINE DESIGNED PREVENTING AGAINST PSEUDOMONAS AERUGINOSA. Russian Journal of Infection and Immunity. 2020;. (In Russ.) https://doi.org/10.15789/2220-7619-OES-1369
Просмотров: 350
Послать статью по эл. почте 