Получение, оценка специфической активности и подлинности рекомбинантной вакцины, предназначенной для профилактики синегнойной инфекции

Целью исследования было получение и характеристика рекомбинантной вакцины, предназначенной для иммунопрофилактики инфекций, вызываемых Pseudomonas aeruginosa. При создании вакцины использован комплекс двух высокоиммуногенных рекомбинантных белков P. aeruginosa. Первый компонент вакцины представлял собой рекомбинантную форму белка F наружной мембраны (OprF), а второй — рекомбинантную атоксическую форму (анатоксин) экзотоксина А. Эти антигены позволили разработать вакцину, стимулирующую иммунные реакции против поверхностных структур бактерии и способствующую синтезу нейтрализующих антител против экзотоксина А, одного из наиболее опасных факторов патогенности P. aeruginosa. Рекомбинантные белки синтезировали в клетках Escherichia coli и выделяли в результате двухэтапной очистки. В случае рекомбинантного белка OprF на первом этапе получали осадок, содержащий гидрофобную фракцию белков продуцента, а в случае рекомбинантного анатоксина — тельца-включения. На втором этапе проводили аффинную хроматографию в колонках с никель-сефарозой. Очищенные рекомбинантные белки диализовали против буферного раствора, содержащего 50 mМ Tris-HCl (pH 9,0) и 0,01% Tween 20, а затем стерилизовали фильтрацией. Для исследования были получены три серии рекомбинантной вакцины синегнойной (РВС), в которой рекомбинантные антигены находились в сорбированном с гидроокисью алюминия состоянии. В этой вакцине рекомбинантный белок OprF использовали в дозе 25 мкг, а рекомбинантный анатоксин — в дозе 50 мкг. Определение полноты сорбции рекомбинантных антигенов в составе вакцины оценивали методом электрофореза в полиакриламидном геле, используя для нанесения препараты РВС, сконцентрированные ультрафильтрацией в спин-колонках. С целью оценки подлинности рекомбинантной вакцины разработали оригинальный метод. Для этого проводили десорбцию антигенов с последующей концентрацией препарата с помощью спинколонок. Полученные сконцентрированные десорбированные вакцинные препараты анализировали методом электрофореза в полиакриламидном геле и иммуноблоттингом, в результате чего подтвер ждено наличие специфических рекомбинантных антигенов в составе вакцины. Экспериментальные серии РВС проявляли специфическую активность (защитные свойства) в эксперименте на животных (мышах). При этом использована схема двукратной, с двухнедельным интервалом внутрибрюшинной иммунизации, через две недели после которой мышей заражали токсигенной культурой P. aeruginosa штамма PA-103. Индексы эффективности защитных свойств (ИЭ) экспериментальных серий вакцины составляли не менее трех (ИЭ: 3,0–3,3), что превышало в полтора раза эффективность использования компонентов вакцины по отдельности (ИЭ: 2,0–2,3). Таким образом, подтвержден аддитивный эффект использования комплексного препарата для защиты от инфицирования токигенными штаммами синегнойной палочки.

1. Благовидов Д.А., Костинов М.П., Симонова О.И., Шмитько А.Д., Буркина Н.И., Шахназарян М.К. Переносимость вакцины против P. aeruginosa у детей с муковисцидозом и врожденными пороками развития легких // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2016. Т. 15, № 2 (87). С. 55–66. [Blagovidov D.A., Kostinov M.P., Simonova O.I., Shmit’ko A.D., Burkina N.I., Shahnazaryan M.K. The tolerability of the vaccine against P. aeruginosa in children with cystic fibrosis and congenital lung development. Jepidemiologija i vakcinoprofilaktika = Epidemiology and Vaccinal Prevention, 2016, vol. 15, no. 2, pp. 55–66. (In Russ.)] doi: 10.31631/2073-3046-2016-15-2-55-66

2. Калошин А.А., Леонова Е.И., Солдатенкова А.В., Михайлова Н.А. Исследование протективных свойств комплекса рекомбинантного белка F наружной мембраны и рекомбинантного анатоксина Pseudomonas aeruginosa // Вестник Российской академии медицинских наук. 2016. Т. 71, № 1. С. 17–22. [Kaloshin A.A., Leonova E.I., Soldatenkova A.V., Mikhailova N.A. Assessment protective properties of the recombinant complex of the outer membrane protein F and the toxoid of Pseudomonas aeruginosa. Vestnik Rossiiskoi akademii meditsinskikh nauk = Herald of the Russian Academy of Sciences, 2016, vol. 71, no. 1, pp. 117–122. (In Russ.)] doi: 10.15690/vramn584

3. Лазарева А.В., Чеботарь И.В., Крыжановская О.А., Чеботарь В.И., Маянский Н.А. Pseudomonas aeruginosa: патогенность, патогенез и патология // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2015. Т. 17, № 3. С. 170–186. [Lazareva A.V., Chebotar I.V., Kryzhanovskaya O.A., Chebotar V.I., Mayanskiy N.A. Pseudomonas aeruginosa: pathogenicity, pathogenesis and diseases. Klinicheskaya mikrobiologiya i antimikrobnaya khimioterapiya = Clinical Microbiology and Antimicrobial Chemotherapy, 2015, vol. 17, no. 3, pp. 170–186. (In Russ.)]

4. Макаренко Т.А., Станиславский Е.С. Иммунологическое изучение белков клеточной стенки Pseudomonas aeruginosa // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1996. № 2. C. 7–9. [Makarenko T.A., Stanislavskiĭ E.S. An immunological study of the cell-wall proteins of Pseudomonas aeruginosa. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii = Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology, 1996, no. 2, pp. 7–9. (In Russ.)]

5. Патент № 1481962 С Российская Федерация, МПК. A61K 35/74. Способ обезвреживания очищенного экзотоксина А синегнойной палочки; заявлено 1987.07.15: опубликовано 1995.09.06 / Михайлова Н.А., Шаймухаметов Ф.А., Кузнецова Т.Н., Мороз А.Ф. Патентообладатель: УфНИИВС им. И.И. Мечникова, ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи. 3 с. [Patent No. 1481962 С Russian Federation, Int. Cl. A61K 35/74. Method for rendering harmless exonoxin A of Pseudomonas aeruginosa; application: 1987.07.15: date of publication 1995.09.06 / Mikhailova N.A., Shajmukhametov F.A., Kuznetsova T.N., Moroz A.F. Proprietors: Ufimskij nauchnoissledovatel’skij institut vakcin i syvorotok im. I.I.Mechnikova (UfNIIVS im. I.I. Mechnikova), Nauchno-issledovatel’skij institut jepidemiologii i mikrobiologii im. N.F. Gamalei (GU NIIEM im. N.F. Gamalei). 3 p.]

6. Подгорная Л.Г., Дзюбан Н.Ф. Антигенные свойства анатоксина синегнойной палочки и протективное действие антитоксической противосинегнойной сыворотки // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1986. № 6. С. 67–69. [Podgornaia L.G., Dziuban N.F. Antigenic properties of Pseudomonas aeruginosa anatoxin and the protective action of antitoxic anti-Pseudomonas aeruginosa serum. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii = Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology, 1986, no. 6, pp. 67–69. (In Russ.)]

7. Станиславский Е.С., Йоо И., Северцева М.К., Машилова Г.М., Болтуцкий Л.Г. Иммунологическая эффективность и безвредность в эксперименте пиоиммуногена-вакцины против инфекции Pseudomonas aeruginosa // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1982. № 5. С. 70–75. [Stanislavskiĭ E.S., Joó I., Severtsova M.K., Mashilova G.M., Boltutsiĭ L.G. Experimental immunological effectiveness and safety of pyoimmunogen vaccine against Pseudomonas aeruginosa infection. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii = Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology, 1982, no. 5, pp. 70–75. (In Russ.)]

8. Титова Т.И., Сидорова Т.Н., Радкевич С.А., Анциферова Н.Г., Мороз А.Ф. Получение и изучение свойств поливалентной корпускулярной синегнойной вакцины // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1985. № 8. С. 80–88. [Titova T.I., Sidorova T.N., Radkevich S.A., Antsiferova N.G., Moroz A.F. Production and study of the properties of a polyvalent corpuscular Pseudomonas aeruginosa vaccine. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii = Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology, 1985, no. 8, pp. 80–88. (In Russ.)]

9. Фармакопея.рф: сайт о регистрации лекарственных средств в России. Общая фармакопейная статья ОФС.1.2.4.0003.15 Стерильность. [Pharmacopoeia.ru: site about registration of drugs in Russia and EAEU (CIS). General pharmacopoeia monograph GPM.1.2.4.0003.15 Sterility]. URL: https://pharmacopoeia.ru/ofs-1-2-4-0003-15-sterilnost-3 (10.12.2019)

10. Chatterjee M., Anju C.P., Biswas L., Mohan G., Biswas R. Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa and alternative therapeutic options. Int. J. Med. Microbiol., 2016, vol. no. 1, pp. 48–58. doi: 10.1016/j.ijmm.2015.11.004

11. Döring G., Pier G.B. Vaccines and immunotherapy against Pseudomonas aeruginosa. Vaccine, 2008, vol. 26, no. 8, pp. 1011– 1024. doi: 10.1016/j.vaccine.2007.12.007

12. Kaloshin A.A., Gatypova E.V., Mikhailova N.A. Obtaining recombinant forms of the outer membrane protein F of Pseudomonas aeruginosa and assessment of their immunogenic properties. Appl. Biochem. Microbiol., 2011, vol. 47, no. 8, pp. 780–788. doi: 10.1134/S0003683811080060

13. Kaloshin A.A., Isakov M.A., Mihailova N.A., Vertiev Ju.V. Preparation of recombinant atoxic form of exotoxin a from Pseudomonas aeruginosa. Bull. Exper. Biol. Med., 2013, vol. 154, no. 3, pp. 346–350. doi: 10.1007/s10517-013-1947-1

14. Lee N.G., Jung S.B., Ahn B.Y., Kim Y.H., Kim J.J., Kim D.K., Kim I.S., Yoon S.M., Nam S.W., Kim H.S., Park W.J. Immunization of burn-patients with a Pseudomonas aeruginosa outer membrane protein vaccine elicits antibodies with protective efficacy. Vaccine, 2000, vol. 18, no. 18, pp. 1952–1961. doi: 10.1016/S0264-410X(99)00479-X

15. Sambrook J.F., Russell D.W. Molecular cloning: a laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. 2100 p.

16. Shanmugham R., Thirumeni N., Rao V.S., Pitta V., Kasthuri S., Singanallur N.B., Lingala R., Mangamoori L.N., Villuppanoor S.A. Immunocapture enzyme-linked immunosorbent assay for assessment of in vitro potency of recombinant hepatitis B vaccines. Clin. Vaccine Immunol., 2010, vol. 17, no. 8, pp. 1252–1260. doi: 10.1128/CVI.00192-10