Молекулярногенетическая характеристика карбапенем-устойчивого штамма Klebsiella pneumoniae KP254 как представителя эволюционной ветки высоковирулентных штаммов

На основании результатов полногеномного секвенирования дана молекулярно-генетическая характеристика клинического штамма Klebsiella pneumoniae KP254, принадлежащего к клональной группе 23. Известно, что представители данной клональной группы могут обладать высокой вирулентностью и являться возбудителями внебольничных инфекций. Фенотипически штамм K. pneumoniae KP254 характеризуется множественной лекарственной устойчивостью, включая карбапенемы. В структуре хромосомы обнаружены детерминанты антибиотикорезистентности (bla_SHV-1, oqxAB, fosA) и патогенности, кодирующие фимбрии 1 и 3 типов и синтез белка-сидерофора иерсинеобактина. Установлено отсутствие конъюгативного элемента ICEKp1, острова патогенности KPHPI208, а также генов аллантоинового регулона, которыми часто обладают высоковирулентные штаммы. Анализ нуклеотидных последовательностей in silico позволил выявить репликоны плазмид групп несовместимости FII, FIA_HI1/FII_K, Col_440I, Col_pVC, FIB_K, FII_pCRY. В результате объединения контигов относительно референсных последовательностей с использованием сервиса BLASTN определено наличие предположительно двух плазмид антибиотикорезистентности IncFII и IncFII_pCRY и одной плазмиды вирулентности IncFIB_K. В структуру плазмиды вирулентности входят детерминанты белка-сидерофора аэробактина, регулятора мукоидного фенотипа RmpA₂, а также гены устойчивости к тяжелым металлам. Покрытие нуклеотидной последовательности плазмиды вирулентности составило 93% относительно плазмиды вирулентности pK2044 с уровнем идентичности 99,38%, делетированными оказались области, ответственные за синтез сальмохелина и белка RmpA. Набор детерминант антибиотикорезистентности, выявленных в структуре мобилома, включает гены бета-лактамазы LAP-2 (плазмида IncFII_pCRY) — аналога TEM-1, — а также бета-лактамазы расширенного спектра CTX-X-55 (плазмида IncFII). Обе детерминанты являются редко регистрируемыми на территории Российской Федерации. Дополнительно в составе плазмидной ДНК обнаружены широко распространенные гены bla_OXA-1, aac(3’)-IIa, ΔcatB4, aac(6’)-Ib-cr, tet(A), qnrSI, sul2, catA2. В структуре резистома отсутствую гены карбапенемаз, в то время как исследуемый штамм обладает устойчивостью к карбапенемам. В результате анализа транслированных последовательностей генов пориновых белков OmpK35 и OmpK36 обнаружены мутационные изменения, которые привели к формированию стоп-кодона в гене ompK35. Также установлено, что аминокислотная последовательность OmpK36 содержит большое количество замен, вставок и делеций.. Наличие подобных изменений является одним из факторов, определяющих устойчивость к карбапенемам. Синергетический эффект может оказывать активность эффлюксных насосов, присутствующих в структуре генома K. pneumoniae KP254, в частности AcrAB-TolC и KpnEF. Таким образом, у исследуемого штамма наблюдается сохранение наиболее значимых признаков, характерных для представителей эволюционной ветки высоковирулентных штаммов клебсиелл, и в тоже время приобретение генетических детерминант множественной лекарственной устойчивости.

1. Алексеева А.Е., Бруснигина Н.Ф., Солнцев Л.А., Гординская Н.А. Молекулярное типирование клинических изолятов Klebsiella pneumoniae, продуцирующих бета-лактамазы расширенного спектра действия // Клиническая лабораторная диагностика. 2017. Т. 62, № 11. С. 699—704. doi: 10.18821/0869-20842017-62-11-699-704

2. Комисарова Е.В., Воложанцев Н.В. Гипервирулентная Klebsiella pneumoniae — новая инфекционная угроза // Инфекционные болезни. 2019. Т. 17, № 3. С. 81—89. doi: 10.20953/17299225-2019-3-81-89

3. Bertels F., Silander O.K., Pachkov M., Rainey P.B., van Nimwegen E. Automated reconstruction of whole-genome phylogenies from short-sequence reads. Mol. Biol. Evol, 2014, vol. 31, no. 5, pp. 1077—1088. doi: 10.1093/molbev/msu088

4. Bhagirath A.Y., Li Y., Patidar R., Yerex K., Ma X., Kumar A., Duan K. Two component regulatory systems and antibiotic resistance in gram-negative pathogens. Int. J. Mol. Sci., 2019, vol. 20, no. 7: 1781. doi: 10.3390/ijms20071781

5. Bialek-Davenet S., Criscuolo A., Ailloud F., Passet V., Jones L., Delannoy-Vieillard A., Garin B., Le Hello S., Arlet G., Nicolas-Chanoine M.-H., Decre D., Brisse S. Genomic definition of hypervirulent and multidrug-resistant Klebsiella pneumoniae clonal groups. Emerg. Infect. Dis, 2014, vol. 20, no. 11, pp. 1812—1820. doi: 10.3201/eid2011.140206

6. Bulger J., MacDonald U., Olson R., Beanan J., Russo T.A. Metabolite transporter PEG344 is required for full virulence of hy-pervirulent Klebsiella pneumoniae strain hvKP1 after pulmonary but not subcutaneous challenge. Infect. Immun., 2017, vol. 85, no. 10: e00093-17. doi: 10.1128/IAI.00093-17

7. Cabral L., Junior G.V.L., Pereira de Sousa S.T., Dias A.C.F., Lira Cadete L., Andreote F.D., Hess M., de Oliveira V.M. Anthropogenic impact on mangrove sediments triggers differential responses in the heavy metals and antibiotic resistomes of microbial communities. Environ. Pollut., 2016, vol. 216, pp. 460— 469. doi: 10.1016/j.envpol.2016.05.078

8. Carattoli A., Hasman H. PlasmidFinder and in silico pMLST: identification and typing of plasmid replicons in whole-genome sequencing (WGS). Methods Mol. Biol, 2020, vol. 2075, pp. 285-294. doi: 10.1007/978-1-4939-9877-7_20

9. Chen X., He L., Li Y., Zeng Z., Deng Y., Liu Y., Liu J.-H. Complete sequence of a F2:A-:B- plasmid pHN3A11 carrying rmtB and qepA, and its dissemination in China. Vet. Microbiol., 2014, vol. 174, no. 1-2, pp. 267-271. doi: 10.1016/j.vetmic.2014.08.023

10. Chen Y.T., Chang H.Y., Lai Y.C., Pan C.C., Tsai S.F., Peng H.L. Sequencing and analysis of the large virulence plasmid pLVPK of Klebsiella pneumoniae. Gene, 2004, vol. 337, pp. 189-198. doi: 10.1016/j.gene.2004.05.008

11. Cheong H.S., Chung D.R., Park M., Kim S.H., Ko K.S., Ha Y.E., Kang C.I., Peck K.R., Song J.H. Emergence of an extended-spectrum в-lactamase-producing serotype K1 Klebsiella pneumoniae ST23 strain from Asian countries. Epidemiol. Infect., 2017, vol. 145, no. 5, pp. 990-994. doi: 10.1017/S0950268816003113

12. Chou H.C., Lee C.Z., Ma L.C., Fang C.T., Chang S.C., Wang J.T. Isolation of a chromosomal region of Klebsiella pneumoniae associated with allantoin metabolism and liver infection. Infect. Immun., 2004, vol. 72, no. 7, pp. 3783-3792. doi: 10.1128/IAI.72.7.3783-3792.2004

13. Deng Y., He L., Chen S., Zheng H., Zeng Z., Liu Y., Sun Y., Ma J., Chen Z., Liu J.H. F33:A-:B- and F2:A-:B- plasmids mediate dissemination of rmtB-blaCTX-M-9 group genes and rmtB-qepA in Enterobacteriaceae isolates from pets in China. Antimicrob. Agents Chemother., 2011, vol. 55, no. 10, pp. 4926-4929. doi: 10.1128/AAC.00133-11

14. Edelstein M., Pimkin M., Palagin I., Edelstein I., Stratchounski L. Prevalence and molecular epidemiology of CTX-M extended-spectrum в-lactamase-producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae in Russian hospitals. Antimicrob. Agents Chemother., 2003, vol. 47, no. 12, pp. 3724-3732. doi: 10.1128/aac.47.12.3724-3732.2003

15. Fang C.T., Chuang Y.P., Shun C.T., Chang S.C., Wang J.T. A novel virulence gene in Klebsiella pneumoniae strains causing primary liver abscess and septic metastatic complications. J. Exp. Med., 2004, vol. 199, no. 5, pp. 697-705. doi: 10.1084/jem.20030857

16. Gu D., Dong N., Zheng Z., Lin D., Huang M., Wang L., Chan E.W., Shu L., Yu J., Zhang R., Chen S. A fatal outbreak of ST11 carbapenem-resistant hypervirulent Klebsiella pneumoniae in a Chinese hospital: a molecular epidemiological study. Lancet Infect. Dis., 2017, vol. 18, no. 1, pp. 37-46. doi: 10.1016/S1473-3099(17)30489-9

17. Hobbs E.C., Yin X., Paul B.J., Astarita J.L., Storz G. Conserved small protein associates with the multidrug efflux pump AcrB and differentially affects antibiotic resistance. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2012, vol. 109, no. 41, pp. 16696-16701. doi: 10.1073/pnas.12100931

18. Holdsworth S.R., Law C.J. The major facilitator superfamily transporter MdtM contributes to the intrinsic resistance of Escherichia coli to quaternary ammonium compounds. J. Antimicrob. Chemother., 2013, vol. 68, no. 4, pp. 831—839. doi: 10.1093/jac/dks491

19. Hu X., Gou J., Guo X., Cao Z., Li Y., Jiao H., He X., Ren Y., Tian F. Genetic contexts related to the diffusion of plasmid-mediated CTX-M-55 extended-spectrum beta-lactamase isolated from Enterobacteriaceae in China. Ann. Clin. Microbiol. Antimicrob., 2018, vol. 17, no. 1. doi: 10.1186/s12941-018-0265-x

20. Izquierdo L., Coderch N., Pique N., Bedini E., Corsaro M.M., Merino S., Fresno S., Tomas J.M., Regue M. The Klebsiella pneumoniae wabG gene: role in biosynthesis of the core lipopolysaccharide and virulence. J. Bacteriol., 2003, vol. 185, no. 24, pp. 7213-7221. doi: 10.1128/jb.185.24.7213-7221.2003

21. Kiratisin P., Apisarnthanarak A., Saifon P., Laesripa C., Kitphati R., Mundy L.M. The emergence of a novel ceftazidime-resistant CTX-M extended-spectrum beta-lactamase, CTX-M-55, in both community-onset and hospital-acquired infections in Thailand. Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 2007, vol. 58, no. 3, pp. 349-355. doi: 10.1016/j.diagmicrobio.2007.02.005

22. Kucken D., Feucht H., Kaulfers P. Association of qacE and qacEDelta1 with multiple resistance to antibiotics and antiseptics in clinical isolates of Gram-negative bacteria. FEMS Microbiol. Lett., 2000, vol. 183, iss. 1, pp. 95-98. doi: 10.1111/j.1574-6968.2000.tb08939.x

23. Lai Y.C., Lin A.C., Chiang M.K., Dai Y.H., Hsu C.C., Lu M.C., Liau C.Y., Chen Y.T. Genotoxic Klebsiella pneumoniae in Taiwan. PLoS One, 2014, vol. 9, no. 5: e96292. doi: 10.1371/journal.pone.0096292

24. Lev A.I., Astashkin E.I., Kislichkina A.A., Solovieva E.V., Kombarova T.I., Korobova O.V., Ershova O.N., Alexandrova I.A., Malikov V.E., Bogun A.G., Borzilov A.I., Volozhantsev N.V., Svetoch E.A., Fursova N.K. Comparative analysis of Klebsiella pneumoniae strains isolated in 2012—2016 that differ by antibiotic resistance genes and virulence genes profiles. Pathog. Glob. Health, 2018, vol. 112, no. 3, pp. 142-151. doi: 10.1080/20477724.2018.1460949

25. Li J., Zhang H., Ning J., Sajid A., Cheng G., Yuan Z., Hao H. The nature and epidemiology of OqxAB, a multidrug efflux pump. Antimicrob. Resist. Infect. Control., 2019, vol. 8, no. 44. doi: 10.1186/s13756-019-0489-3

26. Li X.-Z., Plesiat P., Nikaido H. The challenge of efflux mediated antibiotic resistance in gram-negative bacteria. Clin. Microbiol. Rev., 2015, vol. 28, no. 2, pp. 337-418. doi: 10.1128/CMR.00117-14

27. Lin T.L., Lee C.Z., Hsieh P.F., Tsai S.F., Wang J.T. Characterization of integrative and conjugative element ICEKp1-associated genomic heterogeneity in a Klebsiella pneumoniae strain isolated from a primary liver abscess. J. Bacteriol., 2008, vol. 190, no. 2, pp. 515-526. doi: 10.1128/JB.01219-07

28. Ma L.-C., Fang C.-T., Lee C.-Z., Shun C.-T., Wang J.-T., Genomic heterogeneity in Klebsiella pneumoniae strains is associated with primary pyogenic liver abscess and metastatic infection. J. Infect. Dis., 2005, vol. 192, no. 1, pp. 117-128. doi: 10.1086/430619

29. Moura A., Soares M., Pereira C., Leitao N., Henriques I., Correia A. INTEGRALL: a database and search engine for integrons, integrases and gene cassettes. Bioinformatics, 2009, vol. 25, no. 8, pp. 1096-1098. doi: 10.1093/bioinformatics/btp105

30. Nzakizwanayo J., Scavone P., Jamshidi S., Hawthorne J.A., Pelling H., Dedi C., Salvage J.P., Hind C.K., Guppy F.M., Barnes L.M., Patel B.A., Rahman K.M., Sutton M.J., Jones B.V. Fluoxetine and thioridazine inhibit efflux and attenuate crystalline biofilm formation by Proteus mirabilis. Sci. Rep., 2017, vol. 7: 12222. doi: 10.1038/s41598-017-12445-w

31. Pan Y.S., Liu J.H., Hu H., Zhao J.F., Yuan L., Wu H., Wang L.F., Hu G.Z. Novel arrangement of the blaCTX-M-55 gene in an Escherichia coli isolate coproducing 16S rRNA methylase. J. Basic. Microbiol., 2013, vol. 53, no. 11, pp. 928-933. doi: 10.1002/jobm.201200318

32. Poirel L., Cattoir V., Soares A., Soussy C.J., Nordmann P. Novel Ambler class A beta-lactamase LAP-1 and its association with the plasmid-mediated quinolone resistance determinant QnrS1. Antimicrob. Agents Chemother., 2007, vol. 51, no. 2, pp. 631- 637. doi: 10.1128/AAC.01082-06

33. Russo T.A., Olson R., Fang C.-T., Stoesser N., Miller M., MacDonald U., Hutson A., Barker J.H., La Hoz R.M., Johnson J.R. for the Hypervirulent Klebsiella pneumoniae Investigator Group (HVKPIG). Identification of biomarkers for differentiation of hypervirulent Klebsiella pneumoniae from classical K. pneumoniae. J. Clin. Microbiol., 2018, vol. 56 (9): e00776-18. doi: 10.1128/JCM.00776-18

34. Russo T.A., Olson R., Macdonald U., Metzger D., Maltese L.M., Drake E.J., Gulick A.M. Aerobactin mediates virulence and accounts for increased siderophore production under iron-limiting conditions by hypervirulent (hypermucoviscous) Klebsiella pneumoniae. Infect. Immun., 2014, vol. 82, no. 6, pp. 2356-2367. doi: 10.1128/IAI.01667-13

35. Russo T.A., Marr C.M. Hypervirulent Klebsiella pneumoniae. Clin. Microbiol. Rev., 2019, vol. 32 (3): e00001-19. doi: 10.1128/CMR.00001-19

36. Siguier P., Perochon J., Lestrade L., Mahillon J., Chandler M. ISfinder: the reference centre for bacterial insertion sequences. Nucleic Acids Res., 2005, vol. 34, pp. D32-D36. doi: 10.1093/nar/gkj014

37. Srinivasan V.B., Rajamohan G. KpnEF, a new member of the Klebsiella pneumoniae cell envelope stress response regulon, is an SMR-type efflux pump involved in broad-spectrum antimicrobial resistance. Antimicrob. Agents Chemother., 2013, vol. 57, no. 9, pp. 4449-4462. doi: 10.1128/AAC.02284-12

38. Struve C., Roe C.C., Stegger M., Stahlhut S.G., Hansen D.S., Engelthaler D.M., Andersen P.S., Driebe E.M., Keim P., Krogfelt K.A. Mapping the evolution of hypervirulent Klebsiella pneumoniae. mBio, 2015, vol. 6 (4): e00630-15. doi: 10.1128/mBio.00630-15

39. Sugawara E., Kojima S., Nikaido H. Klebsiella pneumoniae major porins OmpK35 and OmpK36 allow more efficient diffusion of в-lactams than their Escherichia coli homologs OmpF and OmpC. J. Bacteriol., 2016, vol. 198, no. 23, pp. 3200-3208. doi: 10.1128/JB.00590-16

40. Surgers L., Boyd A., Girard P.M., Arlet G., Decre D. ESBL-producing strain of hypervirulent Klebsiella pneumoniae K2, France. Emerg. Infect. Dis., 2016, vol. 22, no. 9, pp. 1687-1688. doi: 10.3201/eid2209.160681

41. Tsai Y.-K., Fung C.-P., Lin J.-C., Chen J.-H., Chang F.-Y., Chen T.-L., Siu L.K. Klebsiella pneumoniae outer membrane porins OmpK35 and OmpK36 play roles in both antimicrobial resistance and virulence. Antimicrob. Agents Chemother., 2011, vol. 55, no. 4, pp. 1485-1493. doi: 10.1128/AAC.01275-10

42. Villa L., Garci'a-Fernandez A., Fortini D., Carattoli A. Replicon sequence typing of IncF plasmids carrying virulence and resistance determinants. J. Antimicrob. Chemother., 2010, vol. 65, no. 12, pp. 2518—2529. doi: 10.1093/jac/dkq347

43. Wang L., Fang H., Feng J., Yin Z., Xie X., Zhu X., Wang J., Chen W., Yang R., Du H., Zhou D. Complete sequences of KPC-2-encoding plasmid p628-KPC and CTX-M-55-encoding p628-CTXM coexisted in Klebsiella pneumoniae. Front. Microbiol., 2015, 6: 838. doi: 10.3389/fmicb.2015.00838

44. Weston N., Sharma P., Ricci V., Piddock L.J.V. Regulation of the AcrAB-TolC efflux pump in Enterobacteriaceae. Res. Microbiol., 2018, vol. 169, no. 7-8, pp. 425-431. doi: 10.1016/j.resmic.2017.10.005

45. Wu K.M., Li L.H., Yan J.J., Tsao N., Liao T.L., Tsai H.C., Fung C.P., Chen H.J., Liu Y.M., Wang J.T., Fang C.T., Chang S.C., Shu H.Y., Liu T.T., Chen Y.T., Shiau Y.R., Lauderdale T.L., Su I.J., Kirby R., Tsai S.F. Genome sequencing and comparative analysis of Klebsiella pneumoniae NTUH-K2044, a strain causing liver abscess and meningitis. J. Bacteriol., 2009, vol. 191, no. 14, pp. 4492-4501. doi: 10.1128/JB.00315-09

46. Yuan Y., Li Y., Wang G., Li C., Chang Y.F., Chen W., Nian S., Mao Y., Zhang J., Zhong F., Zhang L. BlaNDM-5 carried by a hypervirulent Klebsiella pneumoniae with sequence type 29. Antimicrob. Resist. Infect. Control, 2019, vol. 8: 140. doi: 10.1186/s13756-019-0596-1

47. Zhao W.H., Hu Z.Q. Epidemiology and genetics of CTX-M extended-spectrum в-lactamases in Gram-negative bacteria. Crit. Rev. Microbiol., 2013, vol. 39, no. 1, pp. 79-101. doi: 10.3109/1040841X.2012.691460