Preview

Инфекция и иммунитет

Расширенный поиск

Возможность выявления штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза при сочетании методов иммуноблоттинга и амплификации ДНК

https://doi.org/10.15789/2220-7619-2019-2-404-408

Полный текст:

Аннотация

В системах классификации опасных бактериальных патогенов возбудители мелиоидоза и сапа входят в число наиболее опасных для человека. Кроме того, Burkholderia pseudomallei и Burkholderia mallei являются потенциальными агентами биотерроризма. В связи с этим своевременная диагностика этих микроорганизмов является актуальной. В настоящей работе предпринята попытка разработать способ выявления патогенных буркхольдерий, основанный на сочетании видоспецифичной амплификации ДНК и штаммоспецифичного дот-блот анализа на основе моноклональных антител (МКАт). В работе использовали следующие штаммы патогенных буркхольдерий: B. mallei (C-4, C-5, t-12, B-120, P-1, Мuksuwar-11, Z-12, Zagreb, Ivanovich, 5534), B. pseudomallei (100, 102, 115, 116, 132, 135, 301, 51274, 60913, 61503). Детекцию патогенов проводили методами ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) и дот-блота на основе моноклональных антител к поверхностным структурам буркхольдерий. Для ПЦР-РВ были сконструированы оригинальные праймеры к фрагменту ДНК IS407A-fliP B. mallei и к гену Orf12 B. pseudomallei. Для реакции ПЦР-РВ ДНК выделяли из суспензии бактериальных клеток в концентрации 1 × 104 микробных клеток/мл. Накопление конечного продукта реакции регистрировали с использованием красителя SYBR Green I. Для определения специфичности реакции амплификации регистрировали температуры плавления (Tm) полученных продуктов и проводили их электрофоретический анализ. Показано, что при использовании праймеров к фрагменту ДНК IS407A-fliP выявляются все 10 исследованных штаммов B. mallei, а праймеров к гену Orf12 — все 10 штаммов B. pseudomallei. Сигналов с ДНК гетерологичных микроорганизмов (выделенной из бактериальных суспензий с концентрацией 1 ×107 м.к./мл), в ПЦР-РВ получено не было. Таким образом, ПЦР-РВ дает возможность проводить межвидовую дифференциацию патогенных буркхольдерий. В дот-блот анализе МКАт 3D3 связываются с клетками штаммов обоих возбудителей, то есть демонстрируют родоспецифичность. Моноклональные антитела 2D11, в отличии от МКАт 3D3, избирательно не связываются с клетками штаммов Р1 B. mallei и 100 B. pseudomallei, то есть обладают штаммоспецифическим профилем взаимодействия. Сделан вывод о том, что сочетание видоспецифичной амплификации ДНК (ПЦР-РВ) и иммунного анализа (дот-блот), с использованием набора моноклональных антител различного профиля взаимодействия со штаммами, перспективно для внутривидовой дифференциации патогенных буркхольдерий. 

Об авторах

С. С. Ветчинин
ФБУН Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора
Россия
Ветчинин Сергей Сергеевич, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, ведущий научный сотрудник сектора Лайм-боррелиоза отдела иммунобиохимии патогенных микроорганизмов


И. Ю. Щит
ФБУН Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора
Россия
Щит Ирина Юрьевна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник сектора Лайм-боррелиоза отдела иммунобиохимии патогенных микроорганизмов рганизмов


А. Г. Шевяков
ФБУН Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора
Россия

Шевяков Антон Георгиевич, младший научный сотрудник сектора Лайм-боррелиоза отдела иммунобиохимии патогенных микроорганизмов рганизмов 

Адрес для переписки: Шевяков Антон Георгиевич 142279, Россия, Московская область, Серпуховский р-н, п. Оболенск, ФБУН ГНЦ прикладной микробиологии. Тел.: 8 (4967) 36-07-73 (служебн.).



С. Ф. Бикетов
ФБУН Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора
Россия
Бикетов Сергей Федорович, кандидат биологических наук, зав. отделом иммунобиохимии патогенных микроорганизмов


Список литературы

1. Антонов В.А., Илюхин В.И., Храпова Н.П., Прохватилова Е.В., Викторов Д.В., Сенина Т.В., Будченко А.А., Ткаченко Г.А., Алексеева В.В., Захарова И.Б., Савченко С.С., Зинченко О.В., Сорокина Ю.И., Алексеев В.В. Современные подходы к диагностике сапа и мелиоидоза. Идентификация и типирование B. mallei и B. pseudomallei //Проблемы особо опасных инфекций. 2012. № 2 (112). С. 46–50.

2. Безопасность работы с микроорганизмами I–II групп патогенности (опасности): санитарные правила СП 1.3.1285-03. [Safety of work with microorganisms of the I–II pathogenicity (hazard) groups: sanitary rules SP 1.3.1285-03]

3. Лемасова Л.В., Ткаченко Г.А., Савченко С.С., Бондарева О.С., Антонов В.А. Разработка мультиплексной тест-системы для обнаружения дифференциации Burkholderia mallei и Burkholderia pseudomallei методом ПЦР в режиме реального времени //Проблемы особо опасных инфекций. 2016. Вып. 4. С. 56–59.

4. Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I–IV групп патогенности: методические указания МУ 1.3.2569-09.

5. Федюкина Г.Н., Ветчинин С.С., Баранова Е.В., Рудницкий С.Ю., Соловьев П.В., Колосова Н.В., Бикетов С.Ф. Получение компонентов иммунохроматографического теста для выявления возбудителей сапа и мелиоидоза //Биотехнология. 2015. № 1. С. 85–93.

6. Andersen K., Dargis R., Kemp M., Christensen J.J. Detection of Burkholderia pseudomallei by SYBR green real time PCR. Open Pathol. J., 2009, vol. 3, pp. 30–32.

7. Esters D.M., Dow S.W., Schweizer H.P., Torres A.G. Present and future strategies for melioidosis and glanders. Expert Rev. Anti Infect. Ther., 2010, vol. 8, no. 3. pp. 325–338.

8. Foong Y.C., Tan M.R., Bradbury R.S. Melioidosis: a review. Rural Remote Health., 2014, vol. 14, p. 2763.

9. Gregory B.C., Waag D.M. Glanders. In: Medical aspects of biological warfare. Ed. Dembek Z.F. Washington, DC: Borden Institute Walter Reed Army Medical Center, 2007, pp. 121–146.

10. Houghton R.L., Reed D.E., Hubbard M.A., Dillon M.J., Chen H., Currie B.J., Mayo M., Sarovich D.S., Theobald V., Limmathurot sakul D., Wongsuvan G., Chantratita N., Peacock S.J., Hoffmaster A.R., Duval B., Brett P.J., Burtnick M.N., Aucoin D.P. Development of a prototype lateral flow immunoassay (LFI) for the rapid diagnosis of melioidosis. PLOS Neglected Tropical Dis., 2014. vol. 8, no. 3, pp. 1–10.

11. Lee M.A., Wang D., Yap E.H. Detection and differentiation of Burkholderia pseudomallei, Burkholderia mallei and Burkholderia thailandensis by multiplex PCR. FEMS Immunol. Med. Microbiol., 2005, vol. 43, pp. 413–417.

12. Lowe W., March J.K., Bannell A.J., O’Noill R.L., Robinson R.A. PCR-based methodologies used to detect and differentiate the Burkholderia pseudomallei complex: B. mallei and B. pseudomallei and B. thailandensis. Curr. Issues Mol. Biol., 2013, vol. 22, no. 16 (2), pp. 23–54.

13. Sanford J.P. Pseudomonas species (including melioidosis and glanders). In: Principles and practice of infectious diseases. Eds. Mandell G.L., Bennett J.E., Dolin R. 8th ed. New York, N.Y.: Churchill Livingstone, 1995, pp. 2003–2009. 1

14. Tomaso H., Scholz H.C., Al Dahouk S., Eickhoff M., Treu T.M., Wernery R., Wernery U., Neubauer H. Development of a 5’-nuclease real-time PCR assay targeting fliP for the rapid identification of Burkholderia mallei in clinical samples. Clin. Chem., 2006, vol. 52, no. 2, pp. 307–310.

15. Tomaso H., Scholz H.C., Al Dahouk S., Pitt T.L., Treu T.M., Neubauer H. Development of 5′ nuclease real-time PCR assays for the rapid identification of the Burkholderia mallei/Burkholderia pseudomallei complex. Diagn. Mol. Pathol., 2004, vol. 13, pp. 247–253.


Для цитирования:


Ветчинин С.С., Щит И.Ю., Шевяков А.Г., Бикетов С.Ф. Возможность выявления штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза при сочетании методов иммуноблоттинга и амплификации ДНК. Инфекция и иммунитет. 2019;9(2):404-408. https://doi.org/10.15789/2220-7619-2019-2-404-408

For citation:


Vetchinin S.S., Shchit I.Y., Shevyakov A.G., Biketov S.F. The possibility of identifying individual strains of glanders and melioidosis pathogens with a combination of immunoblotting and DNA amplification methods. Russian Journal of Infection and Immunity. 2019;9(2):404-408. (In Russ.) https://doi.org/10.15789/2220-7619-2019-2-404-408

Просмотров: 134


Creative Commons License
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.


ISSN 2220-7619 (Print)
ISSN 2313-7398 (Online)