Preview

Инфекция и иммунитет

Расширенный поиск

Конструирование рекомбинантных штаммов E. coli — продуцентов специфических антигенов Burkholderia pseudomallei

https://doi.org/10.15789/2220-7619-2019-1-203-208

Полный текст:

Аннотация

Возможность завоза в Российскую Федерацию экзотических инфекций, в том числе и мелиоидоза, лабораторно подтвержденные случаи которого регулярно регистрируются в неэндемичных регионах мира, обуславливает необходимость разработки и совершенствования методов их ускоренной диагностики. Наличие перекрестной реактивности между филогенетически близкими видами рода Burkholderia затрудняет диагностику мелиоидоза методами экспресс-анализа, предусматривающими применение препаратов на основе моноклональных антител к эпитопам экзополисахарида возбудителя. Исследования, направленные на поиск антигенов-мишеней для создания группо- и видоспецифических иммунодиагностических препаратов нового поколения, позволяющих выявлять Burkholderia pseudomallei, не теряют актуальности. Цель работы заключалась в клонировании полных кодирующих последовательностей дифференцирующих поверхностных биополимеров Burkholderia pseudomallei с последующей оптимизацией схемы очистки рекомбинантных антигенов. В результате сравнительного in silico исследования в качестве целевых биомолекул были выбраны обладающие высокой иммуногенностью протеины внешней мембраны B. pseudomallei Omp38 и OmpA/МotB. В ПЦР были получены необходимые для клонирования специфические ампликоны генов omp38 и ompA/motB, которые лигировали с линейным экспрессирующим вектором RIC-Ready pPAL7. Лигазной смесью трансформировали компетентные клетки E. coli C-Мах5α для накопления рекомбинантных плазмидных молекул, после чего их выделяли и вводили в E. сoli BL21(DE3) для высокоэффективной экспрессии рекомбинантных протеинов. По-видимому, из-за мультимерной организации белков стандартная процедура их очистки из нативного клеточного дезинтеграта оказалась неэффективной. Модификация методики очистки привела к повышению концентрации рекомбинантного белка в элюате. Однако ввиду привнесенных денатурирующих условий на промежуточных этапах очистки произошел гидролиз пептидных связей в молекулах целевых протеинов. Предполагаемым местом разрыва являлась ковалентная связь между аминокислотами пролин и аспарагин. В элюатах содержались N-концевые фрагменты, посредством которых рекомбинантные белки были связаны с неподвижной фазой хроматографической колонки. Аминокислотные последовательности N-концевых участков, соответствующих молекулярным массам элюированных пептидов, были оценены на предмет содержания линейных эпитопов. По результатам in silico анализа на исследуемых полипептидах было установлено присутствие ряда участков, обладающих выраженной антигенной активностью. Сконструированные штаммы E. coli BL21(DE3) BpsOmp39 и E. coli BL21(DE3) BpsOmpА являютя продуцентами поверхностных протеинов Omp38 и ОmpA/МotB возбудителя мелиоидоза, очищенные формы которых могут быть использованы в качестве основы разрабатываемых диагностических тест-систем.

Об авторах

Ю. А. Кузютина
ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора
Россия

Кузютина Юлия Александровна - научный сотрудник лаборатории патогенных буркхольдерий.

400131, Волгоград, ул. Голубинская, 7.

Тел.: 8 (8442) 37-37-74. Факс: 8 (8442) 39-33-36.



И. Б. Захарова
ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора
Россия
Кандидат биологических наук, доцент, заведующая отделом микробиологии.

400131, Волгоград, ул. Голубинская, 7.



Д. В. Викторов
ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора
Россия
Доктор биологических наук, доцент, заместитель директора по научно-экспериментальной работе.

400131, Волгоград, ул. Голубинская, 7.



Список литературы

1. Викторов Д.В., Захарова И.Б., Кузютина Ю.А., Лопастейская Я.А. Набор 5’-фосфорилированных олигонуклеотидных праймеров для амплификации методом полимеразной цепной реакции полной кодирующей последовательности гена ompA/motB Burkholderia pseudomallei. Патент РФ, 2608505, C12N1/00, C12Q1/68. 2017.

2. Кузютина Ю.А., Захарова И.Б., Савченко С.С., Лопастейская Я.А., Молчанова Е.В., Викторов Д.В. Поиск потенциальных мишеней для детекции и дифференциации штаммов возбудителей мелиоидоза и сапа // Вестник ВолгГМУ. 2016. № 4 (60). С. 114–117.

3. Онищенко Г.Г., Сандахчиев Л.С., Нетесов С.В., Мартынюк Р.А. Биотерроризм: национальная и глобальная угроза // Вестник РАН. 2003. Т. 73, № 3. С. 195–204.

4. Тетерятникова Н.Н., Захарова И.Б., Подшивалова М.В., Романова А.В., Лопастейская Я.А., Викторов Д.В., Алексеев В.В. Молекулярная детекция интегронов класса 1 у Burkholderia pseudomallei // Проблемы особо опасных инфекций. 2011. № 2 (108). С. 46–49.

5. Храпова Н.П., Алексеев В.В. Современное состояние серодиагностики мелиоидоза // Проблемы особо опасных инфекций. 2011. № 4 (110). С. 18–22.

6. Bielecka M.K., Devos N., Gilbert M., Hung M.C., Weynants V., Heckels J. E., Christodoulides M. Recombinant protein truncation strategy for inducing bactericidal antibodies to the macrophage infectivity potentiator protein of Neisseria meningitidis and circumventing potential cross-reactivity with human FK506-binding proteins. Infect. Immun., 2015, vol. 83, no. 2, pp. 730 –742. doi: 10.1128/IAI.01815-14

7. Currie B.J., Dance D.A.B., Cheng A.C. The global distribution of Burkholderia pseudomallei and melioidosis: an update. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg., 2008, vol. 102, pp. S1–S4. doi: 10.1016/S0035-9203(08)70002-6

8. Gauthier J., Gerome P., Defez M., Neulat-Ripoll F., Foucher B., Vitry T., Crevon L., Valade E., Thibault F.M., Biot F.V. Melioidosis in travelers returning from Vietnam to France. Emerg. Infect. Dis., 2016, vol. 22, no. 9, pp. 1671–1673. doi: 10.3201/eid2209.160169

9. Reyes A.W.B., Simborio H.L.T., Hop H.T., Arayan L.T., Kim S. Molecular cloning, purification and immunogenicity of recombinant Brucella abortus 544 malate dehydrogenase protein. J. Vet. Sci., 2016, vol. 17, no. 1, pp. 119–122. doi: 10.4142/jvs.2016.17.1.119

10. Siritapetawee J., Prinz H., Krittanai C., Suginta W. Expression and refolding of Omp38 from Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis, and its function as a diffusion porin. J. Biochem., 2004, vol. 384, no. 3, pp. 609–617. doi: 10.1042/BJ20041102

11. Tabll A., Abbas A.T., El-Kafrawy S., Wahid A. Monoclonal antibodies: principles and applications of immunodiagnosis and immunotherapy for hepatitis C virus. World J. Hepatol., 2015, vol. 7, no. 22, pp. 2369–2383. doi: 10.4254/wjh.v7.i22.2369

12. Tarelli E., Corran P.H. Ammonia cleaves polypeptides at asparagine proline bonds. J. Pept. Res. 2003, vol. 62, no. 6, pp. 245–251.

13. Trivedi P., Tuteja U., Khushiramani R., Reena J., Batra H.V. Development of a diagnostic system for Burkholderia pseudomallei infections. World J. Microbiol. Biotechnol., 2012, vol. 28, no. 7, pp. 2465–2471. doi: 10.1007/s11274-012-1053-y

14. Workgroup, Planning. Biological and chemical terrorism: strategic plan for preparedness and response. MMWR, 2000, vol. 49, no. RR-4, pp. 1–26.

15. Zhao S., Shi J., Zhang C., Zhao Y., Mao F., Yang W., Bai B., Zhang H., Shi C., Xu Z. Monoclonal antibodies against a Mycobacterium tuberculosis Ag85B-Hsp16. 3 fusion protein. Hybridoma, 2011, vol. 30, no. 5, pp. 427–432. doi: 10.1089/hyb.2011.0047


Дополнительные файлы

1. Титульный лист
Тема
Тип Исследовательские инструменты
Скачать (15KB)    
Метаданные
2. Резюме
Тема
Тип Исследовательские инструменты
Скачать (18KB)    
Метаданные
3. Метаданные
Тема
Тип Исследовательские инструменты
Скачать (13KB)    
Метаданные
4. Подписи авторов
Тема
Тип Исследовательские инструменты
Скачать (302KB)    
Метаданные
5. Рисунок 1
Тема
Тип Исследовательские инструменты
Скачать (4MB)    
Метаданные
6. Рисунок 2
Тема
Тип Исследовательские инструменты
Скачать (5MB)    
Метаданные
7. Рисунок 3
Тема
Тип Исследовательские инструменты
Скачать (4MB)    
Метаданные
8. Подписи к рисункам
Тема
Тип Исследовательские инструменты
Скачать (14KB)    
Метаданные
9. Литература
Тема
Тип Исследовательские инструменты
Скачать (25KB)    
Метаданные
10. Заключение о возможности открытого опубликования
Тема
Тип Исследовательские инструменты
Скачать (394KB)    
Метаданные
11. Сопроводительное письмо
Тема
Тип Исследовательские инструменты
Скачать (298KB)    
Метаданные

Для цитирования:


Кузютина Ю.А., Захарова И.Б., Викторов Д.В. Конструирование рекомбинантных штаммов E. coli — продуцентов специфических антигенов Burkholderia pseudomallei. Инфекция и иммунитет. 2019;9(1):203-208. https://doi.org/10.15789/2220-7619-2019-1-203-208

For citation:


Kuzyutina Y.A., Zakharova I.B., Viktorov D.V. Engineering E. coli recombinant strains for high yield production of Burkholderia pseudomallei specific antigens. Russian Journal of Infection and Immunity. 2019;9(1):203-208. (In Russ.) https://doi.org/10.15789/2220-7619-2019-1-203-208

Просмотров: 75


Creative Commons License
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.


ISSN 2220-7619 (Print)
ISSN 2313-7398 (Online)