Preview

Инфекция и иммунитет

Расширенный поиск

КОНСТРУИРОВАНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ E. COLI - ПРОДУЦЕНТОВ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИГЕНОВ BURKHOLDERIA PSEUDOMALLEI

https://doi.org/10.15789/2220-7619-2019-1-

Аннотация

Возможность завоза в Российскую Федерацию экзотических инфекций, в том числе и мелиоидоза, лабораторно подтвержденные случаи которого регулярно регистрируются в неэндемичных регионах мира, обуславливает необходимость разработки и совершенствования методов их ускоренной диагностики. Наличие перекрестной реактивности между филогенетически близкими видами рода Burkholderia затрудняет диагностику мелиоидоза методами экспресс-анализа, предусматривающими применение препаратов на основе моноклональных антител к эпитопам экзополисахарида возбудителя. Исследования, направленные на поиск антигенов-мишеней для создания группо- и видоспецифических иммунодиагностических препаратов нового поколения, позволяющих выявлять Burkholderia pseudomallei, не теряют актуальности. Цель работы заключалась в клонировании полных кодирующих последовательностей дифференцирующих поверхностных биополимеров Burkholderia pseudomallei с последующей оптимизацией схемы очистки рекомбинантных антигенов. В результате сравнительного in silico исследования в качестве целевых биомолекул были выбраны обладающие высокой иммуногенностью протеины внешней мембраны B. pseudomallei Omp38 и OmpA/МotB. В ПЦР были получены необходимые для клонирования специфические ампликоны генов omp38 и ompA/motB, которые лигировали с линейным экспрессирующим вектором RIC-Ready pPAL7. Лигазной смесью трансформировали компетентные клетки E. coli C-Мах5α для накопления рекомбинантных плазмидных молекул, после чего их выделяли и вводили в E.coli BL21(DE3) для высокоэффективной экспрессии рекомбинантных протеинов. По-видимому, из-за мультимерной организации белков стандартная процедура их очистки из нативного клеточного дезинтеграта оказалась неэффективной. Модификация методики очистки привела к повышению  концентрации рекомбинантного белка в элюате. Однако, ввиду привнесенных денатурирующих условий на промежуточных этапах очистки произошел гидролиз пептидных связей в молекулах целевых протеинов. Предполагаемым местом разрыва являлась ковалентная связь между аминокислотами пролин и аспарагин. В элюатах содержались N-концевые фрагменты, посредством которых рекомбинентные белки были связаны с неподвижной фазой хроматографической колонки. Аминокислотные последовательности N-концевых участков, соответствующих молекулярным массам элюированных пептидов, были оценены на предмет содержания линейных эпитопов. По результатам in silico анализа на исследуемых полипептидах было установлено присутствие ряда участков, обладающих выраженной антигенной активностью. Сконструированные штаммы E. coli BL21(DE3) BpsOmp39 и E. coli BL21(DE3) BpsOmpА являютя продуцентами поверхностных протеинов Omp38 и ОmpA/МotB возбудителя мелиоидоза, очищенные формы которых могут быть использованы в качестве основы разрабатываемых диагностических тест-систем.

Об авторах

Юлия Александровна Кузютина
ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора
Россия
научный сотрудник лаборатории патогенных буркхольдерий ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора


И Б Захарова
ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора
Россия
к.б.н., доцент, зав. отделом микробиологии ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора


Д В Викторов
ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора
Россия
д.б.н., доцент, заместитель директора по научно-экспериментальной работе ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора


Список литературы

1. Викторов Д.В., Захарова И.Б., Кузютина Ю.А., Лопастейская Я.А. Набор 5'-фосфорилированных олигонуклеотидных праймеров для амплификации методом полимеразной цепной реакции полной кодирующей последовательности гена ompA/motB Burkholderia pseudomallei. Патент РФ, 2608505, C12N1/00, C12Q1/68. 2017. https://edrid.ru/rid/217.015.95a5.html

2. Кузютина Ю.А., Захарова И.Б., Савченко С.С., Лопастейская Я.А., Молчанова Е.В., Викторов Д.В. Поиск потенциальных мишеней для детекции и дифференциации штаммов возбудителей мелиоидоза и сапа // Вестник ВолгГМУ. 2016. № 4(60). С. 114-117. Kuzyutina Y.A., Zakharova I.B., Savchenko S.S., et al. Search for potential targets for detection and differentiation the causative agents of melioidosis and glanders strains. Journal of Volgograd State Medical University. 2016, no. 4(60), pp. 114-117. http://www.volgmed.ru/uploads/journals/articles/1494484558-vestnik-2016-4-2842.pdf

3. Онищенко Г.Г., Сандахчиев Л.С., Нетесов С.В., Мартынюк Р.А. Биотерроризм: Национальная и глобальная угроза // Вестник РАН. 2003. Т. 73. № 3. С. 195-204.

4. Onishchenko G.G., Sandakhchiev L.S., Netesov S.V., Martynyuk R.A. Bioterrorism: national and global threat. RAS Bulletin. 2003, vol. 73, no. 3, pp. 195–204. https://elibrary.ru/item.asp?id=17184608

5. Тетерятникова Н.Н., Захарова И.Б., Подшивалова М.В., Романова А.В., Лопастейская Я.А., Викторов Д.В., Алексеев В.В. Молекулярная детекция интегронов класса 1 у Burkholderia pseudomallei // Проблемы особо опасных инфекций. 2011. № 2(108). С. 46-49. Teteryatnikova N.N., Zakharova I.B., Podshivalova M.V., Romanova A.V., Lopasteiskaya Ya.A., Viktorov D.V., Alekseev V.V. Molecular detection of class 1 integrons in Burkholderia pseudomallei. Problems of Particularly Dangerous Infections. 2011, no. 2(108), pp. 46-49. https://elibrary.ru/item.asp?id=16395747

6. Храпова Н.П., Алексеев В.В. Современное состояние серодиагностики мелиоидоза // Проблемы особо опасных инфекций. 2011. № 4(110). С. 18-22. Khrapova N.P., Alekseev V.V. Current state of human melioidosis serodiagnostics. Problems of Particularly Dangerous Infections. 2011, no. 4(110), pp. 18-22. https://elibrary.ru/item.asp?id=17077640&

7. Bielecka M.K., Devos N., Gilbert M., Hung M.C., Weynants V., Heckels J. E., Christodoulides M. Recombinant protein truncation strategy for inducing bactericidal antibodies to the macrophage infectivity potentiator protein of Neisseria meningitidis and circumventing potential cross-reactivity with human FK506-binding proteins. Infect. Immun., 2015, vol. 83, no. 2, pp. 730–742. http://iai.asm.org/content/83/2/730.full

8. [doi: 10.1128/IAI.01815-14]

9. Currie B.J., Dance D.A.B., Cheng A.C. The global distribution of Burkholderia pseudomallei and melioidosis: an update. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg., 2008, vol. 102, pp. S1–4. https://academic.oup.com/trstmh/article-abstract/102/Supplement_1/S1/1922164?redirectedFrom=fulltext

10. [doi: 10.1016/S0035-9203(08)70002-6]

11. Gauthier J., Gerome P., Defez M., Neulat-Ripoll F., Foucher B., Vitry T., Crevon L., Valade E., Thibault F.M., Biot F.V. Melioidosis in travelers returning from Vietnam to France. Emerg. Infect. Dis., 2016, vol. 22, no. 9, pp. 1671-1673. https://www.ncbi.nlm.nih.ggo/pmc/articles/PMC4994349/pdf/16-0169.pdf

12. [doi: 10.3201/eid2209.160169]

13. Reyes A.W.B., Simborio H.L.T., Hop H.T., Arayan L.T., Kim S. Molecular cloning, purification and immunogenicity of recombinant Brucella abortus 544 malate dehydrogenase protein. J. Vet. Sci., 2016, vol. 17, no. 1, pp. 119–122. https://www.synapse.koreamed.org/Synapse/Data/PDFData/0118JVS/jvs-17-119.pdf

14. [doi: 10.4142/jvs.2016.17.1.119]

15. Siritapetawee J., Prinz H., Krittanai C., Suginta W. Expression and refolding of Omp38 from Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis, and its function as a diffusion porin. J. Biochem., 2004, vol. 384, no. 3, pp. 609-617. http://www.biochemj.org/content/384/3/609

16. [doi: 10.1042/BJ20041102]

17. Tabll A., Abbas A.T., El-Kafrawy S., Wahid A. Monoclonal antibodies: principles and applications of immunodiagnosis and immunotherapy for hepatitis C virus. World J. Hepatol , 2015, vol. 7, no. 22, pp. 2369-2383. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4598607/pdf/WJH-7-2369.pdf [doi: 10.4254/wjh.v7.i22.2369]

18. Tarelli E., Corran P. H. Ammonia cleaves polypeptides at asparagine proline bonds. J. Pept. Res. 2003, vol. 62, no. 6, pp. 245-251. https://onlinelibrary.wiley.com/doi/pdf/10.1046/j.1399-3011.2003.00089.x

19. Trivedi P., Tuteja U., Khushiramani R., Reena J., Batra H.V. Development of a diagnostic system for Burkholderia pseudomallei infections. World J. Microbiol. Biotechnol., 2012, vol. 28, no. 7, pp. 2465-2471. https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs11274-012-1053-y [doi: 10.1007/s11274-012-1053-y]

20. Workgroup, Planning. Biological and chemical terrorism: strategic plan for preparedness and response. MMWR., 2000, vol. 49, no. RR-4, pp. 1-26. https://www.cdc.gov/mmwr/pdf/rr/rr4904.pdf

21. Zhao S., Shi J., Zhang C., Zhao Y., Mao F., Yang W., Bai B., Zhang H., Shi C., Xu Z. Monoclonal antibodies against a Mycobacterium tuberculosis Ag85B-Hsp16. 3 fusion protein. Hybridoma, 2011, vol. 30, no. 5, pp. 427-432. https://www.liebertpub.com/doi/abs/10.1089/hyb.2011.0047

22. [doi: 10.1089/hyb.2011.0047]


Дополнительные файлы

1. Титульный лист
Тема
Тип Исследовательские инструменты
Скачать (15KB)    
Метаданные
2. Резюме
Тема
Тип Исследовательские инструменты
Скачать (18KB)    
Метаданные
3. Метаданные
Тема
Тип Исследовательские инструменты
Скачать (13KB)    
Метаданные
4. Подписи авторов
Тема
Тип Исследовательские инструменты
Скачать (302KB)    
Метаданные
5. Рисунок 1
Тема
Тип Исследовательские инструменты
Скачать (4MB)    
Метаданные
6. Рисунок 2
Тема
Тип Исследовательские инструменты
Скачать (5MB)    
Метаданные
7. Рисунок 3
Тема
Тип Исследовательские инструменты
Скачать (4MB)    
Метаданные
8. Подписи к рисункам
Тема
Тип Исследовательские инструменты
Скачать (14KB)    
Метаданные
9. Литература
Тема
Тип Исследовательские инструменты
Скачать (25KB)    
Метаданные
10. Заключение о возможности открытого опубликования
Тема
Тип Исследовательские инструменты
Скачать (394KB)    
Метаданные
11. Сопроводительное письмо
Тема
Тип Исследовательские инструменты
Скачать (298KB)    
Метаданные

Для цитирования:


Кузютина Ю.А., Захарова И.Б., Викторов Д.В. КОНСТРУИРОВАНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ E. COLI - ПРОДУЦЕНТОВ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИГЕНОВ BURKHOLDERIA PSEUDOMALLEI. Инфекция и иммунитет. 2019;. https://doi.org/10.15789/2220-7619-2019-1-

For citation:


Kuzyutina Y.A., Zakharova I.B., Viktorov D.V. ENGINEERING E. COLI RECOMBINANT STRAINS FOR HIGH YIELD PRODUCTION OF BURKHOLDERIA PSEUDOMALLEI SPECIFIC ANTIGENS. Russian Journal of Infection and Immunity. 2019;. https://doi.org/10.15789/2220-7619-2019-1-

Просмотров: 15


Creative Commons License
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.


ISSN 2220-7619 (Print)
ISSN 2313-7398 (Online)