Preview

Инфекция и иммунитет

Расширенный поиск

Проточная цитометрия при анализе вируснейтрализующей активности антирабических сывороток и иммуноглобулина

https://doi.org/10.15789/2220-7619-2019-1-107-114

Полный текст:

Аннотация

В настоящем исследовании рассматривается разработка метода определения уровня антирабических антител в иммунных сыворотках и препарате иммуноглобулина с использованием проточной цитометрии. Метод основан на измерении уровня флуоресценции в клетках Vero, инкубированных в питательной среде с добавлением смеси разведений антирабических сывороток или препарата иммуноглобулина и аттенуированного штамма вируса бешенства «Москва 3253», адаптированного к репродукции на перевиваемых клеточных линиях. Для определения уровня антител образцы антирабических сывороток и иммуноглобулина следует разводить в солевом растворе соответственно в 20 и 200 раз. При этом рекомендуемая доза вируса должна составлять 0,1 ИД50 на 1 клетку. Для фиксации и пермеабилизации клеточной мембраны применяли реагент Cytoperm/Cytofix (BD Pharmingen, США), содержащий формальдегид. Этот компонент способен инактивировать вирус бешенства, что позволяет считать предлагаемый метод соответствующим принципам биологической безопасности. Для окрашивания предлагается использовать конъюгат антирабического иммуноглобулина с ФИТЦ (ФГБУ ВНИИЗЖ, Россия). Данное обстоятельство не ограничивает примененние аналогичных препаратов, предназначенных для этой цели. Цитометрические исследования осуществляли на проточном цитометре, снаряженным аргоновым лазером мощностью 20 МВт, при длине волны эмиссии 488 нм со скоростью 500 клеток в секунду. Инфицированными  считали те клетки, значения интенсивности флуоресценции которых составили более 10 условных единиц. Использование проточной цитометрии позволяет определить точное количество инфицированных клеток в исследуемой суспензии, а также степень их инфицирования по интенсивности флуоресценции. Уровень содержания антител в исследуемых образцах учитывают по калибровочному графику, построенному на основании данных исследования стандартного образца активности антирабического иммуноглобулина, имеющего активность 30 МЕ в 1 мл (NIBSC, Великобритания). Установлена высокая степень корреляции результатов, полученных с помощью предлагаемого метода в сравнении с результатами, полученных и других методов определения активности антирабических препаратов — биологической реакции нейтрализации вируса на белых мышах (0,92) и модифицированного метода FAVN (0,98). При этом сравнение результатов анализа уровня антирабических антител, полученных с применением проточной цитометрии, и результатов, полученными в тестах in vivo, проведено впервые. Возможность быстрого получения результата, а также точного определения степени инфицирования клеток по интенсивности флуоресценции позволит использовать предлагаемый метод на этапах контроля в производстве разрабатываемых и выпускаемых иммунобиологических антирабических препаратов.

Об авторах

С. В. Генералов
ФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора
Россия

Генералов Сергей Вячеславович - кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории профилактических иммуноглобулинов отдела профилактических препаратов.

410005, Саратов, ул. Университетская, 46.

Тел.: 8 (452) 26-21-31.

SPIN-код: 4130-2475



А. Л. Кравцов
ФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора
Россия
Доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник отдела иммунологии.

410005, Саратов, ул. Университетская, 46.



В. А. Кожевников
ФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора
Россия

Младший научный сотрудник отдела иммунологии.

410005, Саратов, ул. Университетская, 46.



Ю. К. Гаврилова
ФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора
Россия
Научный сотрудник лаборатории профилактических иммуноглобулинов отдела профилактических препаратов.

410005, Саратов, ул. Университетская, 46.



Е. Г. Абрамова
ФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора
Россия
Доктор биологических наук, главный научный сотрудник лаборатории профилактических иммуноглобулинов отдела профилактических препаратов.

410005, Саратов, ул. Университетская, 46.



А. К. Никифоров
ФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора
Россия
Доктор биологических наук, заместитель директора по экспериментальной и производственной работе.

410005, Саратов, ул. Университетская, 46.



Список литературы

1. Вишняков И.Ф., Недосеков В.В., Груздев К.Н., Балышев В.М., Жестерев В.И., Горшкова Т.Ф. Способ определения антирабических вируснейтрализующих антител. Патент РФ 2130187. Опубл. 10.05.1999.

2. Гаврилова Ю.К., Генералов С.В., Абрамова Е.Г., Савицкая Л.В., Галкина М.В., Кочкин А.В. Экспресс-анализ активности антирабических сывороток и иммуноглобулина в клеточных культурах методом иммунофлуоресценции // Биотехнология. 2018. Т. 34, № 4. С. 83–88.

3. Генералов С.В., Абрамова Е.Г., Савицкая Л.В., Лобовикова О.А., Никифоров А.К. Программа для расчета результатов реакции нейтрализации вируса бешенства на белых мышах по методу Рида и Менча. Свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ № 2016617051. 23 июня 2016 г.

4. Кравцов А.Л., Генералов С.В., Кожевников В.А., Гаврилова Ю.К., Абрамова Е.Г., Кочкин А.В., Никифоров А.К. Определение доли инфицированных вирусом бешенства к леток линии Vero с помощью проточной цитометрии // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2018. № 3. С. 18–25.

5. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа, 1990. 352 с.

6. Онищенко Г.Г., Попова А.Ю., Еж лова Е.Б., Демина Ю.В., Пакскина Н.Д., Писцов М.Н., Рубцов В.В., Суровяткин А.В., Петров А.А., Казанцев А.В., Бережной А.М., Зверев А.Ю., Маношкин А.В., Кротков В.Т., Кутаев Д.А., Максимов В.А., Кузнецов С.Л., Вахнов Е.Ю., Тимофеев М.А., Мовсесянц А.А., Борисевич С.В. Эпидемиологическая обстановка и вопросы индентификации вируса бешенства среди людей на территории Российской Федерации в период 2002–2015 гг. // Проблемы особо опасных инфекций. 2017. № 3. С. 27–32.

7. Сибиряк С.В., Хайдуков С.В., Зурочка А.В. Оценка апоптоза в иммунологических исследованиях. Вопросы современной проточной цитометрии. К линическое применение. Челябинск: Бумажный двор, 2008. 195 с.

8. Фрешни Р.Я. Культура животных к леток: практическое руководство. М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2010. 691 с.

9. Bedekovic T., Lemo N., Lojkic I., Mihaljevic Z., Jungic A., Cvetnic Z., Cac Z., Hostnik P. Modification of the f luorescent antibody virus neutralization test — еlimination of the cytotoxic effect for the detection of rabies virus neutralising antibodies. J. Virol. Methods, 2013, vol. 189, no. 1, pp. 204–208. doi: 10.1016/j.jviromet.2013.01.022

10. Bordignon J., Ferreira S., Caporale G., Carreri M.L., Kotait I., Lima H.C. Zanetti C.R. Flow cytometry assay for intracellular rabies virus detection. J. Virol. Methods, 2002, vol. 105, no. 1, pp. 181–186. doi: 10.1016/S0166-0934(02)00064-2

11. Bordignon J., Comin F., Ferreira S., Caporale G., Lima Filho J.H., Zanetti C.R. Calculating rabies virus neutralizing antibodies titres by f low cytometry. Rev. Inst. Med. Trop. Sao Paulo, 2002, vol. 44, no. 3, pp. 151–154.

12. Meslin F.-X., Kaplan M.M., Koprowski H. Laboratory techniques in rabies. 4th ed. Geneva, Switzerland: WHO, 1996, 476 p.

13. Vengatesan D., Raj G.D., Raja A., Ramadass P., Gunaseelan L. Detection of rabies virus antigen or antibody using f low cytometry. Cytometry. 2006, vol. 70B, no. 5, pp. 335–343. doi: 10.1002/cyto.b.20104

14. WHO Expert Consultation on Rabies: second report. WHO technical report series 982. Geneva, Switzerland, 2013, 139 p.


Дополнительные файлы

1. Метаданные
Тема
Тип Исследовательские инструменты
Скачать (16KB)    
Метаданные
2. Подписи
Тема
Тип Исследовательские инструменты
Скачать (632KB)    
Метаданные
3. Титульный лист
Тема
Тип Исследовательские инструменты
Скачать (17KB)    
Метаданные
4. Резюме
Тема
Тип Исследовательские инструменты
Скачать (15KB)    
Метаданные
5. рисунок 1
Тема
Тип Исследовательские инструменты
Скачать (11KB)    
Метаданные
6. рисунок 2
Тема
Тип Исследовательские инструменты
Скачать (3MB)    
Метаданные
7. рисунок 3
Тема
Тип Исследовательские инструменты
Скачать (11KB)    
Метаданные
8. Подписи к рисункам
Тема
Тип Исследовательские инструменты
Скачать (15KB)    
Метаданные
9. Таблица
Тема
Тип Исследовательские инструменты
Скачать (16KB)    
Метаданные
10. Литература
Тема
Тип Исследовательские инструменты
Скачать (25KB)    
Метаданные
11. Направительное письмо
Тема
Тип Исследовательские инструменты
Скачать (535KB)    
Метаданные
12. Экспертное заключение
Тема
Тип Исследовательские инструменты
Скачать (793KB)    
Метаданные
13. Статья без рисунков и таблицы
Тема
Тип Исследовательские инструменты
Скачать (48KB)    
Метаданные
14. Статья с исправленими
Тема
Тип Прочее
Скачать (395KB)    
Метаданные
15. Статья с исправлениями без рисунков
Тема
Тип Прочее
Скачать (54KB)    
Метаданные
16. Резюме с исправленими
Тема
Тип Прочее
Скачать (18KB)    
Метаданные
17. Список литературы с исправлениями
Тема
Тип Прочее
Скачать (26KB)    
Метаданные

Для цитирования:


Генералов С.В., Кравцов А.Л., Кожевников В.А., Гаврилова Ю.К., Абрамова Е.Г., Никифоров А.К. Проточная цитометрия при анализе вируснейтрализующей активности антирабических сывороток и иммуноглобулина. Инфекция и иммунитет. 2019;9(1):107-114. https://doi.org/10.15789/2220-7619-2019-1-107-114

For citation:


Generalov S.V., Kravtsov A.L., Kozhevnikov V.A., Gavrilova Y.K., Abramova E.G., Nikiforov A.K. Flow cytometry for the analysis of virusneytralizing activity of antirabies serum and immunoglobulin drug. Russian Journal of Infection and Immunity. 2019;9(1):107-114. (In Russ.) https://doi.org/10.15789/2220-7619-2019-1-107-114

Просмотров: 78


Creative Commons License
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.


ISSN 2220-7619 (Print)
ISSN 2313-7398 (Online)