Preview

Инфекция и иммунитет

Расширенный поиск

Подавление цикла вируса гепатита в под действием нуклеолитических систем CRISPR/Cas9 и белка HBx

https://doi.org/10.15789/2220-7619-2019-3-4-476-484

Полный текст:

Аннотация

Вирус гепатита В (ВГВ) может вызывать хронический гепатит В (ХГВ) — тяжелое хроническое заболевание печени инфекционной природы. По последним данным официального статистического наблюдения, число больных ХГВ в мире превышает 250 млн человек, а в Российской Федерации составляет около 3 млн человек. Противовирусные препараты (аналоги нуклеоз(т)идов и пегилированный интерферон) подавляют репликацию и транскрипцию вируса, однако не способны полностью элиминировать его из организма. Причиной этого является стабильная форма генома ВГВ — кольцевая ковалентно замкнутая ДНК (ккзДНК), которая представляет из себя компактную минихромосому, экранированную от воздействия противовирусных препаратов. Необходимым шагом для излечения ХГВ является разработка новых терапевтических подходов, направленных на разрушение или инактивацию матриц ккзДНК. Системы сайтспецифических нуклеаз CRISPR/Cas9 способны вносить двуцепочечные разрывы в практически любые заданные участки ДНК. Ранние работы по использованию сайт-специфичных нуклеаз CRISPR/Cas9 для ВГВ продемонстрировали эффективное разрезание ккзДНК, однако деградации всех матриц добиться не удалось. Вероятно, причиной этого являются структурные особенности ккзДНК, которая может существовать в гетерохроматизированном состоянии, недоступном для действия белков-нуклеаз CRISPR/Cas9. Один из активаторов транскрипции, вирусный белок HBx, способен релаксировать структуру ккзДНК, привлекая к ним факторы, ремоделирующие хроматин. Белок HBx активирует транскрипцию ВГВ и способствует расплетению структуры ккзДНК, делая ее более доступной для систем CRISPR/Cas9. В данной работе было изучено влияние белка HBx дикого типа, а также мутантных, более безопасных форм НВх белка (HBxMut, который не взаимодействует с факторами Bcl-2 и Bcl-xL, и HBxNESM, который не вызывает образование активных форм кислорода и не индуцирует двуцепочечные разрывы в геноме) на эффективность систем CRISPR/Cas9. Выяснилось, что Нbх белок и его мутантные формы способны значительно увеличить эффективность систем CRISPR/Cas9, подавляя транскрипцию вирусной прегеномной РНК вплоть до 98%. Были определены оптимальные соотношения и концентрации плазмид, кодирующих элементы систем CRISPR/ Cas9 и белков HBx. Кроме того, было показано, что белки HBx в выбранном диапазоне концентраций не вызывают изменений пролиферации и жизнеспособности клеток. Таким образом, совместное действие систем сайт-специфических нуклеаз CRISPR/Cas9 и вирусного белка-активатора HBx значительно подавляет транскрипцию вируса гепатита В.

Об авторах

С. А. Брезгин
ФБУН Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора; ФГБУ ГНЦ Институт иммунологии ФМБА России
Россия

младший научный сотрудник лаборатории вирусных гепатитов;

аспирант лаборатории № 73 клинической фармакологии,

Москва



А. П. Костюшева
ФБУН Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора
Россия

младший научный сотрудник лаборатории вирусных гепатитов,

111123, Москва, ул. Новогиреевская, 3А



В. Н. Симирский
Институт биологии развития имени Н.К. Кольцова РАН

к.б.н., старший научный сотрудник,

Москва



Е. В. Волчкова
ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова МЗ РФ
Россия

д.м.н., профессор кафедры инфекционных болезней, зав. кафедрой инфекционных болезней медико-профилактического факультета,

Москва



Д. С. Чистяков
ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова МЗ РФ

лаборант,

Москва



Д. С. Костюшев
ФБУН Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора

научный сотрудник,

Москва



В. П. Чуланов
ФБУН Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора; ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова МЗ РФ

д.м.н., зав. лабораторией вирусных гепатитов;

профессор кафедры инфекционных болезней медико-профилактического факультета,

Москва



Список литературы

1. Allweiss L., Dandri M. The Role of cccDNA in HBV Maintenance. Viruses, 2017, vol. 9, no. 6: 156. doi: 10.3390/v9060156

2. Belloni L., Pollicino T., De Nicola F., Guerrieri F., Raffa G., Fanciulli M., Levrero M. Nuclear HBx binds the HBV minichromosome and modifies the epigenetic regulation of cccDNA function. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2009, vol. 106, no. 47, pp. 19975– 19979. doi: 10.1073/pnas.0908365106

3. Bock C.T., Schwinn S., Locarnini S., Fyfe J., Manns M.P., Trautwein C., Zentgraf H. Structural organization of the hepatitis B virus minichromosome. J. Mol. Biol., 2001, vol. 307, no. 1, pp. 183–196. doi: 10.1006/jmbi.2000.4481

4. Cha M.-Y., Kim C.-M., Park Y.-M., Ryu W.-S. Hepatitis B virus X protein is essential for the activation of Wnt/beta-catenin signaling in hepatoma cells. Hepatology, 2004, vol. 39, no. 6, pp. 1683–1693. doi: 10.1002/hep.20245

5. Dong C., Qu L., Wang H., Wei L., Dong Y., Xiong S. Targeting hepatitis B virus cccDNA by CRISPR/Cas9 nuclease efficiently inhibits viral replication. Antiviral Res., 2015, vol. 118, pp. 110–117. doi: 10.1016/j.antiviral.2015.03.015

6. Forgues M., Marrogi A.J., Spillare E.A., Wu C.G., Yang Q., Yoshida M., Wang X.W. Interaction of the hepatitis B virus X protein with the Crm1-dependent nuclear export pathway. J. Biol. Chem., 2001, vol. 276, no. 25, pp. 22797–22803. doi: 10.1074/jbc.M101259200

7. Ganem D., Prince A.M. Hepatitis B virus infection — natural history and clinical consequences. N. Engl. J. Med., 2004, vol. 350, no. 11, pp. 1118–1129. doi: 10.1056/NEJMra031087

8. Geng X., Huang C., Qin Y., McCombs J.E., Yuan Q., Harry B.L., Xue D. Hepatitis B virus X protein targets Bcl-2 proteins to increase intracellular calcium, required for virus replication and cell death induction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2012, vol. 109, no. 45, pp. 18471–18476. doi: 10.1073/pnas.1204668109

9. Kim S., Lee H.-S., Ji J.-H., Cho M.-Y., Yoo Y.-S., Park Y.-Y., Cho H. Nuclear expression of hepatitis B virus X protein is associated with recurrence of early-stage hepatocellular carcinomas: role of viral protein in tumor recurrence. J. Pathol. Transl. Med., 2016, vol. 50, no. 3, pp. 181–189. doi: 10.4132/jptm.2016.03.18

10. Konerman M.A., Lok A.S. Interferon treatment for hepatitis B. Clin. Liver Dis., 2016, vol. 20, no. 4, pp. 645–665. doi: 10.1016/j.cld.2016.06.002

11. Liu Y., Zhao M., Gong M., Xu Y., Xie C., Deng H., Wang Z. Inhibition of hepatitis B virus replication via HBV DNA cleavage by Cas9 from Staphylococcus aureus. Antiviral Res., 2018, vol. 152, pp. 58–67. doi: 10.1016/j.antiviral.2018.02.011

12. Lucifora J., Xia Y., Reisinger F., Zhang K., Stadler D., Cheng X., Volz T. Specific and nonhepatotoxic degradation of nuclear hepatitis B virus cccDNA. Science, 2014, vol. 343, no. 6176, pp. 1221–1228.

13. Nassal M. HBV cccDNA: viral persistence reservoir and key obstacle for a cure of chronic hepatitis B. Gut, 2015, vol. 64, no. 12, pp. 1972–1984. doi: 10.1136/gutjnl-2015-309809

14. Ramanan V., Shlomai A., Cox D.B.T., Schwartz R.E., Michailidis E., Bhatta A., Bhatia S.N. CRISPR/Cas9 cleavage of viral DNA efficiently suppresses hepatitis B virus. Sci. Rep., 2015, vol. 5: 10833. doi: 10.1038/srep10833

15. Seeger C., Sohn J.A. Targeting hepatitis B virus with CRISPR/Cas9. Mol. Ther. Nucleic Acids, 2014, vol. 3: e216. doi: 10.1038/mtna.2014.68

16. Seeger C., Sohn J.A. Complete spectrum of CRISPR/Cas9-induced mutations on HBV cccDNA. Mol. Ther., 2016, vol. 24, no. 7, pp. 1258–1266. doi: 10.1038/mt.2016.94

17. Shi H., Lu L., Zhang N.-P., Zhang S.-C., Shen X.-Z. Effect of interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha on hepatitis B virus following lamivudine treatment. World J. Gastroenterol., 2012, vol. 18, no. 27, pp. 3617–3622. doi: 10.3748/wjg.v18.i27.3617

18. Uusi-Mäkelä M.I.E., Barker H.R., Bäuerlein C.A., Häkkinen T., Nykter M., Rämet M. Chromatin accessibility is associated with CRISPR-Cas9 efficiency in the zebrafish (Danio rerio). PLoS One, 2018, vol. 13, no. 4: e0196238–e0196238. doi: 10.1371/journal. pone.0196238

19. Verkuijl S.A., Rots M.G. The influence of eukaryotic chromatin state on CRISPR-Cas9 editing efficiencies. Curr. Opin. Biotechnol., 2018, vol. 55, pp. 68–73. doi: 10.1016/j.copbio.2018.07.005

20. WHO. Global hepatitis report 2017. World Health Organization, 2017.

21. Yue D., Zhang Y., Cheng L., Ma J., Xi Y., Yang L., Xiang R. Hepatitis B virus X protein (HBx)-induced abnormalities of nucleic acid metabolism revealed by 1 H-NMR-based metabonomics. Sci. Rep., 2016, vol. 6: 24430. doi: 10.1038/srep24430


Дополнительные файлы

1. Резюме
Тема
Тип Чистый текст
Скачать (18KB)    
Метаданные
2. Титульный лист
Тема
Тип Чистый текст
Скачать (14KB)    
Метаданные
3. файла Рисунок_1. Карта генома в ВГВ c отмеченными участками-мишенями для РНК-проводников
Тема
Тип Результаты исследования
Скачать (301KB)    
Метаданные
4. Рисунок_2. Экспрессия прегеномной РНК после действия системы S.pyogenes CRISPRCas9 при ко-трансфекции с белком НВх
Тема
Тип Результаты исследования
Скачать (328KB)    
Метаданные
5. файла Рисунок_3. Подбор оптимальных соотношений, кодирующих плазмид Cas9, НВх или мутантных форм (HBxmut, HBxNESM).
Тема
Тип Результаты исследования
Скачать (215KB)    
Метаданные
6. Рисунок_4. Иммуноцитохимическое окрашивание на НВх белки, трансфицированные в клетки HepG2
Тема
Тип Результаты исследования
Скачать (581KB)    
Метаданные
7. Рисунок_5. Влияние НВх белков дикого типа и мутантных форм (HBxmut, HBxNESM) на пролиферацию и жизнеспособность клеток
Тема
Тип Результаты исследования
Скачать (130KB)    
Метаданные
8. Данные для построения графиков
Тема
Тип Данные
Скачать (16KB)    
Метаданные
9. Литература
Тема
Тип Прочее
Скачать (20KB)    
Метаданные
10. Метаданные с подписями
Тема
Тип Чистый текст
Скачать (199KB)    
Метаданные
11. Подавление цикла вируса гепатита В под действием нуклеолитических систем CRISPR/Cas9 и белка HBx.
Тема
Тип Прочее
Скачать (21KB)    
Метаданные
12. Подавление цикла вируса гепатита В под действием нуклеолитических систем CRISPR/Cas9 и белка HBx.
Тема
Тип Прочее
Скачать (19KB)    
Метаданные

Для цитирования:


Брезгин С.А., Костюшева А.П., Симирский В.Н., Волчкова Е.В., Чистяков Д.С., Костюшев Д.С., Чуланов В.П. Подавление цикла вируса гепатита в под действием нуклеолитических систем CRISPR/Cas9 и белка HBx. Инфекция и иммунитет. 2019;9(3-4):476-484. https://doi.org/10.15789/2220-7619-2019-3-4-476-484

For citation:


Brezgin S.A., Kostyusheva A.P., Simirsky V.N., Volchkova E.V., Chistyakov D.S., Kostyushev D.S., Chulanov V.P. Suppression of hepatitis b virus by a combined activity of CRISPR/Cas9 and HBx proteins. Russian Journal of Infection and Immunity. 2019;9(3-4):476-484. (In Russ.) https://doi.org/10.15789/2220-7619-2019-3-4-476-484

Просмотров: 76


Creative Commons License
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.


ISSN 2220-7619 (Print)
ISSN 2313-7398 (Online)